Gravidanza

Amniocentesi

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L’amniocentesi consiste nel prelievo di liquido amniotico (LA), eseguito per via transaddominale mediante ago ecoguidato. L’analisi del cariotipo fetale viene eseguito sugli amniociti isolati da 15-20 ml di liquido amniotico posto in coltura per circa due settimane. Recentemente sono state introdotte tecniche diagnostiche che utilizzano cellule fetali (eritroblasti) ed ancora più recentemente il DNA fetale presente nel sangue materno sul quale si evidenziano il cariotipo fetale e le alterazioni dei cromosomi X, Y, 13, 18, 21 e, più recentemente le cromosomopatie di tutti i cromosomi (1-4).

Indicazioni: l’amniocentesi fu introdotta nel 1877 per ridurre la quantità di liquido in caso di polidrmnios. Solo successivamente il campo di applicazione fu esteso alla diagnostica prenatale di alterazioni cromosomiche mediante studio del cariotipo fetale su banda larga e ancora in seguito sono stati introdotti gli studi  sulle alterazioni dei singoli geni (1).  Altre indicazioni includono valutazione del feto per infezione, grado di anemia emolitica, tipo di sangue o piastrine, emoglobinopatia, difetti del tubo neurale e maturità polmonare. L’amniocentesi viene anche eseguita come procedura terapeutica per rimuovere il liquido amniotico in eccesso, come nella sindrome trasfusionale gemello-gemello, o per ridurre il volume e la pressione del liquido amniotico nei casi di prolasso delle membrane fetali nel secondo trimestre per facilitare il posizionamento di un cerchiaggio di emergenza (5-7).

AMNIOCENTESI PRECOCE: si definisce precoce perché si esegue entro le 20 settimane di età gestazionale ossia al’inizio del secondo trimestre. Sebbene si possa già effettuare alla 12a settimana, preferiamo attendere 16a settimana, in quanto l’utero ha un volume adeguato, il rischio di aborto è minore e il numero di cellule desquamate dal feto o dalla membrana amniotica è adeguato.
L’epoca gestazionale ottimale per l’esecuzione dell’amniocentesi trans-addominale è quella che va dalla 16ª alla 18ª settimana.  Eseguirla prima non é opportuno per la difficoltà nel penetrare nel sacco amniotico, per la scarsità di liquido e la presenza di muco celomatico che può occludere il lume dell’ago. Inoltre prima della 16a settimana i falsi positivi e i falsi negativi sono più frequenti. ed ancora l’A. effettuata precocemente è gravata da una percentuale di aborti maggiore del 2%. Alla 16-18a settimana l’utero ha un volume adeguato ed è facilmente palpabile al di sopra della sinfisi pubica, il volume del liquido amniotico supera i 100 ml e nello stesso liquido è sufficientemente elevato il numero delle cellule che si sfaldano dalla cute e dalle mucose fetali.

La villocentesi e l’amniocentesi sono le due tecniche invasive di prelievo che vengono utilizzate con successo da circa trent’anni sia per la diagnosi delle anomalie cromosomiche, attraverso l’analisi del cariotipo delle cellule fetali, che per la diagnosi delle malattie monogeniche, mediante lo studio del DNA estratto dalle cellule fetali. La villocentesi viene eseguita, intorno all’11a-13a settimana mentre l’amniocentesi si effettua a partire dalla 15a settimana di gestazione (8-11).

Tecnica per il prelievo di liquido amniotico: Cateterismo di una vena periferica (radiale), infusione lenta (10 gocce/minuto) di una soluzione glucosata al 5% (o fisiologica in caso di paziente diabetica) contenente 2 fiale di Spasmex®e iniezione intramuscolo di 1/2 fiala di Atropina solfato.
Disinfezione della cute addominale con garze sterili imbevute di soluzione di  Betadine; lavaggio con acqua depurata e detersione con garze sterili.
Delimitazione del campo operatorio con telini sterili.
Individuazione ecografica del punto ottimale per l’infissione dell’ago mediante sonda lineare forata o sonda convex da 5-7 mHz munita di kit per biopsia, utilizzando gel ecografico sterile. 
Anestesia locale con clorulo di etile a spruzzo o modesta infiltrazione sottocutanea con Mepivacaina cloridrato al 20% (Carbosen©). 
Viene inserito l’ago con mandrino attraverso le pareti addominali osservandone la  progressione  sul monitor. La direzione dell’ago deve essere perpendicolare alla parete uterina non a quella addominale. La parete prossimale della cavità amniotica si trova a 5-10 cm dal piano cutaneo. Quando il mandrino viene rimosso il liquido amniotico, sotto la spinta della pressione endoamniotica, comincerà subito a sgorgare dall’ago. Si raccorda la siringa all’ago e si aspirano 20 ml di liquido amniotico. I primi 2 ml sono utilizzati per le indagini biochimiche e i restanti per le indagini genetiche. Il L. A. prelevato si ricostituisce nel giro di 3 ore.
Noi effettuiamo una profilassi con tocolitici ed antibiotici a largo spettro (eritromicina) per 3 giorni (-1  e + 2 dall’amnio) e,  in caso di paziente RH negativa, somministrazione i.m. di  200 mg di γ-globuline anti-D (1). Dopo circa un’ora dal prelievo verrà effettuata un controllo ecografico per rassicurare la paziente (ed anche per una tutela legale dell’operatore) sulla presenza del battito cardiaco fetale e sulla presenza di una discreta tasca residua di liquido amniotico. La paziente verrà tenuta sotto osservazione nello studio medico o ambulatorio per 30′ circa e quindi potrà  tornare al proprio domicilio con la terapia summenzionata e con la raccomandazione di evitare sforzi e non sollevare pesi per 3-4 giorni (12-16).
Gli aghi che usiamo sono:
a) Ago di Chiba modificato (Eco jekt® 21 G x 200 mm della Hospital Service Pomezia –Roma- ). Kit per amniocentesi con ago a diametro variabile,  consente di pungere  con il più piccolo diametro mentre il corpo, a diametro maggiore, garantisce stabilità e precisione durante l’aspirazione del liquido amniotico.  E’ caratterizzato da una variazione di 2G di diametro tra la punta e il corpo della cannula. L’ago è completo di mandrino estraibile perfettamente accoppiato all’ago. Il Fermo scorrevole e la centimetratura dell’ago consentono un controllo sicuro della profondità di penetrazione. Il marker ecogeno interno consente una buona ecoriflettenza dell’ago. Cono luer trasparente con codice colore. Guaina coprisonda in polietilene sterile monouso. Gel sterile. Telo per campo sterile 60×60 cm e telo con foro centrale 60×45 cm. N°3 provette da 15 ml. N°2 siringhe da 20 cc con attacco luer lock. Pinzetta anatomica. N° 2 batuffoli di garza e n° 2 vaschette per il disinfettante.
b) EXO-AMNIOS® della Crinospital: set completo per l’amniocentesi transaddominale comprendente un ago con mandrino della lunghezza di 10 cm e diametro di 0.9 mm, siringa da 10 cc e provetta.
c)  Ago spinale diametro 22 G, lunghezza 12.70 cm,
d) Ago della Becton-Dickinson (Rutherford USA), ∅ 0.72 mm
I RISCHI DELL’AMNIOCENTESI:
1) Rischi preesistenti al concepimento: età materna avanzata, genitori portatori di riarrangiamenti cromosomiali, anamnesi familiare positiva per anomalie cromosomiche precedenti a carico dei figli (o aborti), necessità di determinazione del sesso fetale per le malattie congenite X-Y-lynked (emofilia), rischio di malattie genetiche individuabili con l’analisi di specifici siti genici (anemie a cellule  falciformi, fenilchetonuria, distrofia muscolare di Duchenne, distrofia muscolare di Steinert, ecc.); malattie metaboliche come la m. di Tay-Sachs (17-27).
2) Rischi successivi al concepimento: malformazioni fetali, ritardo di crescita fetale, patologia del liquido amniotico (oligo/polidramnios), patologia annessiale (arteria ombelicale unica, cisti del cordone ombelicale), mola vescicolare, iposviluppo fetale molto precoce, igroma cistico, bleb nucale, nuchal translucency aumentata, bi/tri-test alterato, dubbi sull’anatomia fetale, rischio di malformazioni del tubo neurale (in questo caso si effettua nel liquido amniotico il dosaggio dell‘a-FP e dell’acetilcolinesterasi (28-33)
 RISCHI e COMPLICANZE  PRECOCI DELL’AMNIOCENTESI:
  • Aborto: 0.1%: oggigiorno è la vera unica complicanza dell’amniocentesi considerate le percentuali estremamente basse delle altre complicanze sottoelencate (2,3). In caso di inizio di contrazioni uterine, basta aumentare la velocità di infusione della ritodrina in flebo. In assenza di tocolitici pronti all’uso, si può ricorrere a modeste dosi (15 cc) di superalcolici (grappa, wisky, cognac).
  • Lipotimia materna: legata allo stress emotivo ed alla stimolazione vagale provocata dal passaggio dell’ago; non si osserva nelle p/ti pre-medicate con atropina.
  • Piede torto: 0.5%; nelle pazienti con amniocentesi <16 settimane presenta una percentuale di 1.5%.
  • Morte fetale: per puntura cardiaca, grave lacerazione di un vaso ombelicale o  per notevole incremento dell’immunizzazione Rh in gestante già isoimmunizzata.
  • Infezioni intramniotiche fetali e corionamnionite
  • Isoimmunizzazione RH: passaggio di modeste quantità di emazie fetali nel circolo sanguigno materno; ciò può comportare immunizzazione nelle donne Rh (D) negative oppure un aumento del titolo di anticorpi anti-D in donne già immunizzate.
  • bleeding placentare.
  • rottura dei vasi uterini con possibilità di emorragie
  • enfisema della parete addominale.
  • rottura delle membrane: generalmente queste sono rotture alte e non pregiudicano il proseguimento della gravidanza.
  • ferita fetale, in genere arto,  da puntura dell’ago: rarissime data la prontezza con cui il feto retrae l’arto punto dall’ago; alla nascita si potrebbero riscontrare cicatrici cutanee.

Terapia per prevenire le complicazioni da amniocentesi da praticare nei tre giorni precedenti e successivi all’amnio:

  1. Somministrazione di progestinici: Progeffik cpr os/vaginali 200 mg (1 cprx2/die
  2. Magnesio (tocolitico): Semel cpr o Mag 2 flaconcini os: una compressa o flacomcino mattina e sera
  3. Zitromax cpr 500 mg


ESAMI SU LIQUIDO AMNIOTICO:
a) Cariotipo con tecnica di coltivazione cellulare per la determinazione del sesso e soprattutto per l’individuazione di anomalie cromosomiche numeriche (aneuploidie) come trisomia 21 (Down Syndrome), trisomia 18 (Edwards Syndrome), trisomia 13 (S. del “cri du cat”), S. di Turner 45X, S. di Klinefelter 47XXY, S. di Jacobs 47,XYY e strutturali .
b) FISH (Fluorescent In situ Hybridation) o, ancor meglio, la reazione a catena della polimerasi (qFPCR) : permette di individuare sequenze specifiche di DNA in 1-2 giorni  su amniociti non coltivati. Lo studio parziale del DNA: aggiunge alla diagnosi di tutte le patologie cromosomiche, anche le malattie genetiche più frequenti, come la Fibrosi Cistica, la Atrofia Muscolare, Spinale (SMA), il ritardo mentale da X-fragile. la Sordità ereditaria.
c) Chromosomal microarray analysis (CMA): il CMA offre ulteriori vantaggi diagnostici rispetto all’esame standard del cariotipo rivelando squilibri sub-microscopici o copie di variazioni numeriche troppo piccole per essere viste su una preparazione cromosomica con banda G standard. Questi squilibri submicroscopici vengono anche chiamati microdelezioni e microduplicazioni, in particolare quando includono specifiche regioni genomiche associate a sequele cliniche. Non tutte le microdelezioni/duplicazioni sono associate a fenotipi clinici patologici ma in molti casi la loro presenza è senza conseguenze cliniche (15).
c) dosaggio dell’α-feto-proteina amniotica (sospetto di mielomeningocele, spina bifida, rene policistico, onfalocele, Down)
d) dosaggio del 17-OH-Progesterone amniotico per la diagnosi di CAH (iperplasia surrenalica congenita)
e) determinazione del gruppo sanguigno fetale
f) dosaggio della creatinina: un eventuale aumento di questa proteina denuncia una disfunzione del rene fetale;
g) dosaggio della bilirubina: aumenta in caso di anemia emolitica;
h) ricerca diretta nel liquido di agenti infettivi tramite l’amplificazione del genoma di virus batteri e protozoi (citomegalovirus,  parvovrus B19, toxoplasma, escherichia coli, etc.).

 AMNIOCENTESI TARDIVA: viene eseguita dopo le 20 settimane di gestazione; in realtà il maggior numero di amniocentesi tardive viene eseguito tra la 26ª e la 28ª w.
Le indicazioni più importanti sono:
a) valutazione della maturità polmonare fetale (L/S)
b) valutazione delle condizioni fetali in caso di isoimmunizzazione materno-fetale (dosaggio della bilirubina amniotica, emocromo fetale ed in particolare la percentuale di reticolociti).
c) introduzione nel sacco amniotico di sostanze medicamentose o nutritive a scopo terapeutico
d) amnioinfusione:in caso di grave oligoamnios;  infusione di 10 cc di soluzione fisiologica/settimane di gravidanza
e) amnioriduzione: si effettua nelle situazioni di polidramnios grave, quando la sovradistensione dell’utero crea una situazione a rischio di parto pre-termine. Infatti l’utero, essendo un muscolo, quando si distende troppo inizia a contrarsi, analogamente a quanto succede a termine di gravidanza. I farmaci in questi casi tendono a dare un beneficio solo momentaneo, e la procedura di amnioriduzione può essere più efficace. La decisione di quando fare l’amnioriduzione dipende non solo dal livello di liquido amniotico, ma anche dalla rapidità di insorgenza del polidramnios
f) aspirazione di  liquido amniotico nel polidramnios (amniocentesi evacuativa).
La tecnica è uguale a quella utilizzata per l’A. precoce. In mancanza di attrezzature ultrasonografiche, si può procedere a mano libera, “open amnio”  La via d’accesso più facile è la zona sovrapubica nello spazio ottenuto spingendo delicatamente in alto la testa fetale (foto). Altri punti di ingresso possono essere la zona in corrispondenza delle piccole parti fetali e la zona a ridosso del solco formato fra nuca e dorso del feto allargata da una lieve pressione della mano dell’operatore sul segmento superiore del dorso fetale.
Le possibili complicanze dell’amniocentesi tardiva sono le stesse descritte per l’amniocentesi precoce: emor. Lagia, di solito é di scarsa entità; l’inconveniente maggiore che comporta é la commistione del sangue materno con il liquido amniotico, cosa che può ridurre il valore di certe determinazioni o impedire l’esecuzione.  Eccezionalmente vi può essere la formazione nella parete addominale o nella parete uterina di un ematoma che va trattato in modo conservativo. infezione: con tecnica accurata dovrebbe essere un evento eccezionale. Talvolta dopo l’amniocentesi si osserva un breve episodio di brivido, forse dovuto a penetrazione di liquido amniotico o sangue fetale nel torrente circolatorio materno. Immunizzazione materna o accentuazione di uno stato di preesistente sensibilizzazione: questo rischio si concretizza soprattutto quando l’amniocentesi non é preceduta da localizzazione ecografica placentare e con l’ago si attraverso anche zone periferiche della placenta. Infatti, in tal caso, é possibile favorire il passaggio di sangue fetale nel circolo materno e provocare o aggravare fenomeni di immunizzazione. Per le donne Rh (D) negative non immunizzate vi é pertanto chi consiglia di somministrare profilatticamente una dose standard di immunoglobuline anti-D subito dopo l’amniocentesi (36-40).
Le possibili complicazioni fetali sono le seguenti:
  • Induzione di travaglio di parto pretermine quando il feto non ha ancora raggiunto un sufficiente grado di maturità;
  • traumi fetali: in cui le reazioni del feto sono ritardate, abitualmente il feto si retrae vivacemente dalla punta dell’ago, motivo per cui la possibilità di una lesione diretta  piuttosto remota,  denunciata solo dalla presenza di sangue fetale nel liquido amniotico e non seguita da conseguenze di rilievo.
  • lesioni di un grosso vaso fetale a livello della placenta, lesioni che possono comportare anche la morte del feto per dissanguamento. Per fortuna, lesioni di tale gravità sono eccezionali, anche quando l’ago perfora accidentalmente la placenta.

Amniocentesi e cellule staminali: esistono cellule staminali biologicamente molto attive, totipotenti, in grado di moltiplicarsi numerose volte e di differenziarsi in quasi tutti i tessuti dell’organismo. Scoperte nel 2007 da un gruppo di ricercatori italo-americani sono oggetto di numerosi trials clinici e studi scientifici (4).

ultrascreen: il Consiglio Superiore della Sanità, su indicazione ministeriale, ha emanato una Direttiva per cui non è più consentita l’amniocentesi in Convenzione alle gravide di età >35 anni se non dopo aver effettuato la translucenza nucale (11-13 settimane di gestazione)  e il bi-test (free-HCG + PAPP-A). I risultati di questi due esami vengono combinati insieme in quello che viene chiamato ultrascreen (il risultato della combinazione tra questi valori e l’età materna offre un rischio probabilistico). Solo se il risultato dell’ultrascreen è positivo alla donna verrà accordata l’amniocentesi a totale carico del SSN.
LA DIAGNOSTOCA PRENATALE NON INVASIVA (NIPD) SU CELLULE FETALI:
Negli ultimi decenni sono state sviluppate importanti linee di ricerca che hanno aperto nuove prospettive nel campo della diagnosi prenatale non invasiva (NIPD) in epoca gestazionale precoce, sia per la diagnosi delle aneuploidie che delle malattie monogeniche. Nel 1893 è stata dimostrata la presenza di cellule fetali nel sangue materno fin dalla 6-8a settimana. Da quel momento sono stati effettuati studi su trofoblasti, eritroblasti e linfociti fetali fino alle attuali tecniche di diagnostica prenatale non invasiva sul DNA di queste cellule fetali. Attualmente con la NIPD è possibile rilevare la trisomia 21 (S. di Down), la trisomia 18 (S. di Edwards), trisomia 13 (S. di Patau), monosomia X (sindrome X0 o S. di Turner), S. della tripla X (XXX), S. di Klinefelter (XXY), S. di Jacobs (XYY), il sesso fetale, malattie legate al cromosoma X come l’emofilia e la distrofia muscolare di Duchenne. L’ostacolo maggiore è rappresentato dall’esiguo numero delle cellule fetali presenti nel circolo materno ed ulteriore decremento di esse durante le fasi di arricchimento. 
I trofoblasti oltrepassano facilmente la barriera placentare, si riversano nel sangue materno durante la gravidanza e possono essere distinti sulla base di una morfologia definita.  Durante il primo trimestre di gravidanza, le cellule del trofoblasto si sfaldano dalla loro sede anatomica e raggiungono la circolazione materna grazie al sangue che irrora gli spazi tra i villi. I trofoblasti presenti nella circolazione materna, vengono rapidamente intrappolati nei polmoni, questo causa una rapida e considerevole diminuzione del loro numero La mancanza di anticorpi specifici rende difficile l’isolamento e l’arricchimento dei trofoblasti fetali. Inoltre un altro problema è rappresentato dal fatto che l’1% delle cellule del trofoblasto presentano un cariotipo a mosaico che potrebbe inficiare l’esito della diagnosi (Henderson et al., 1996). Le problematiche ed i limiti appena descritti non consentono l’utilizzo di questa popolazione cellulare per condurre una NIPD.
Linfociti fetali: anch’essi non sono utilizzabili come target ideale per lo sviluppo della NIDP.
Eritroblasti: l’eritropoiesi primitiva avviene nel sacco vitellino mentre l’eritropoiesi definitiva ha luogo prevalentemente nel fegato fetale e nel midollo osseo. Le cellule eritroidi primitive sono presenti nelle isole di sangue del sacco vitellino fino alla sesta settimana.  La placenta umana sarebbe il sito anatomico dove gli eritroblasti primitivi perderebbero il nucleo; l’enucleazione comporterebbe l’interazione con i macrofagi nello stroma dei villi coriali dove si completerebbe il processo di apoptosi nucleare mentre la trasformazione finale in eritrociti avviene nel fegato fetale. Gli eritroblasti primitivi, isolati dal sangue materno di donne in gravidanza, possiedono nuclei picnotici molto densi ed hanno una morfologia differente rispetto a quelli presenti nel feto, probabilmente a causa della differenza di saturazione dell’ossigeno tra il sangue fetale e quello materno. Il numero degli eritroblasti fetali circolanti (NRBC: Nucleated Red Blood Cells) nel sangue venoso materno è variabile ed in media sono presenti in percentuale di 1/100 eritrociti materni; tale percentuale tende ad aumentare con l’epoca gestazionale. Gli NRBC fetali sono per le caratteristiche su esposte ritenuti il tipo cellulare più appropriato per la NIPD.
Tuttavia diverse evidenze sperimentali dimostrano che a fronte dei successi ottenuti nel campo dello screening non invasivo delle aneuploidie più frequenti (ad es. trisomie 21 e 18), esiste ancora un cospicuo numero di anomalie cromosomiche fetali (ad es. traslocazioni de novo, aneuploidie rare, inversioni de novo, ecc) che sfugge ai test di screening non invasivi. In uno studio retrospettivo pubblicato recentemente è stato stimato che il numero di tali cromosomopatie, associate a fenotipi clinici rilevanti, che potrebbero sfuggire alla diagnosi eseguita solo attraverso i test di screening non invasivi sia nelle donne a rischio (età >35 anni) che in quelle non a rischio (età <35 anni) per gravidanze con anomalie cromosomiche fetali sia circa il 50%.
DNA fetale libero nel circolo materno: la grande difficoltà di impiegare le cellule fetali nella pratica diagnostica, ha orientato numerosi gruppi di ricerca verso lo studio del DNA fetale libero scoperto (Lo Y. 1997) nel plasma materno. Il DNA fetale è rilevabile sin dalla quinta settimana di gestazione, la sua concentrazione aumenta nelle settimane successive raggiungendo una quantità sufficiente per l’esame alla 10a settimana e scompare dopo il parto. Con l’esame del DNA fetale  (G-test, Safe test, Smart test, Praena test, Tranquility, Aurora, etc.) ci si limita allo studio di soli cinque cromosomi (13,18,21 e quelli sessuali, X e Y) e alcune comuni sindromi da microdelezione/microduplicazione (S. di Di George, S. cri-du-chat, etc… Pertanto, la NIPD sarà un esame che viaggerà in parallelo ad amniocentesi e villocentesi che saranno sempre necessarie per lo studio degli altri cromosomi (per esempio, il cromosoma (35-41).
 
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5 Comments

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