Andrologia, Spermiogramma

Spermiogramma

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Spermiogramma: è l’analisi macroscopica e microscopica del liquido seminale. L’analisi  macroscopica comprende valutazione del volume, aspetto, pH, fluidificazione e viscosità  mentre la fase microscopica intende studiare concentrazione, motilità e morfologia degli spermatozoi al fine di un corretto inquadramento diagnostico del paziente con problemi di fertilità (1-4).

  •  Raccolta campione – Il campione iniziale deve essere raccolto tramite masturbazione dopo un periodo di astinenza sessuale di un tempo minimo di 2 giorni ad un massimo di 7  giorni. Rispettare il periodo di astinenza sessuale permette di paragonare i dati seminali a valori standard di normalità. Inoltre, un’astinenza troppo prolungata provoca accumulo di spermatozoi con possibile riduzione della motilità e alterazione della morfologia, mentre un’astinenza troppo breve può causare la riduzione del volume dell’eiaculato e del numero degli spermatozoi. La raccolta tramite coito interrotto non è una modalità idonea in quanto si può verificare la perdita della prima frazione dell’eiaculato, che di solito contiene la più alta concentrazione di spermatozoi e può comportare una contaminazione del liquido seminale con secrezioni vaginali che possono interferire sulla motilità degli spermatozoi. Essendo il campione molto sensibile a sbalzi di temperatura, è importante una volta compiuta la raccolta evitare escursioni termiche durante il trasporto del campione e prima dell’esame; il liquido seminale  va mantenuto ad una temperatura stabile (non inferiore a 20°C e non superiore a 30°C) fino al momento dell’analisi.

 

 

  • La fluidificazione del liquido seminale segue l’iniziale coagulazione; avviene in 15-30 minuti.  Se dopo 60 minuti la fluidificazione non è completa, si parla di fluidificazione ritardata, quadro compatibile con disturbi prostatici. La misurazione viene effettuata facendo percolare il liquido lungo le pareti della provetta osservando la qualità del liquido contro una sorgente luminosa.
  • Viscosità –  La misurazione della viscosità avviene facendo gocciolare il liquido da una pipetta, osservando come le gocce dovrebbero susseguirsi in maniera ritmica una dopo l’altra. Una diminuzione della viscosità può associarsi a scarsa componente cellulare spermatica mentre l’aumento della viscosità visibile con la formazione di filamenti può derivare da uno stato di flogosi delle vie spermatiche.
  • Volume:  v.n. 1.5-6 ml; il liquido seminale è secreto dalle ghiandole seminali (prostata, vescicole seminali e ghiandole bulbo-uretrali di Cooper). Il volume >6 ml è rappresentato come iperposia e si ritrova spesso in condizioni di flogosi delle vie seminali; un volume seminale <1.5 ml è definito come ipoposia e si riscontra in caso di ostruzione o agenesia dei dotti deferenti, occlusione o agenesia delle vescicole seminali, eiaculazione retrograda parziale, ipogonadismo e problemi immunologici.
  • Concentrazione degli spermatozoi: il numero degli spermatozoi è valutato al M.O. utilizzando la camera di Makler (Sefi Medical Instrument, Haifa, Israel). In caso di criptozoospermia però, è necessario ricorrere alla camera di Neubauer che nel quadrato centrale contiene 25 piccoli quadrati ognuno dei quali contiene 20 celle in cui contare gli spermatozoi.   Per l’esame con la camera di Neubauer, in base al numero di spermatozoi che si sono apprezzati con la camera di Makler,  si scelgono le due diluizioni più opportune.  Il valore ottenuto con l’apposita formula (es: Diluizione 1+4 (1:5) C = (N/n) × 0.25; C = concentrazione spz mil/ml, N = numero totale di spermatozoi contati, n = numero di righe contate) viene poi moltiplicato per il volume totale, così da ottenere il numero totale di spermatozoi nell’eiaculato. Il numero medio di spermatozoi totali nel liquido seminale dovrebbe essere 40.000.000-200.000.000 con variazioni fisiologiche del 10-30% fra un esame e l’altro ma negli ultimi decenni si assiste ad una progressiva diminuzione della popolazione spermatozoaria a livello mondiale.  Tale declino è dovuto a condizioni di vita sedentaria, cattiva alimentazione, obesità, diabete, inquinamento ambientale. Nel 2010 la WHO (WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen) realizzò delle linee guida per la valutazione della concentrazione degli spermatozoi nel liquido seminale esprimendo un cut-off di normalità fra 15 e 250 milioni di spz/ml e proponendo quindi la seguente classificazione:
    • spz/ml  <156 : oligospermia lieve
    • spz/ml  <106: oligospermia media
    • spz/ml <5.000.000:  oligospermia severa
    • pochi e rari spermatozoi: criptospermia
    • spz/ml >250×106 polispermia 
  • morfologia –  La morfologia è uno dei parametri che meglio riflette l’integrità e la funzionalità degli spermatozoi. Essa è strettamente correlata al tasso di concepimento spontaneo e al tasso di fertilizzazione in vitro. Lo spermatozoo maturo è costituito da una parte anteriore, ovoidale, chiamato testa, seguita da una porzione chiamata collo,  un tratto intermedio e dal tratto finale o coda. La testa contiene  il nucleo a cui è appoggiato anteriormente l’acrosoma che contiene gli enzimi necessari alla penetrazione dello spz nell’ovocita. La morfologia spermatica viene valutata a fresco, appena effettuata la liquefazione completa del liquido seminale, al M.O. in contrasto di fase con ingrandimento a 200-400X  dopo aver strisciato e colorato con Papanicolau il preparato su vetrino. Si contano le percentuali di anomalie su 200 spz e le anomalie vengono suddivise in anomalie della testa, della coda e del pezzo intermedio. Nel 2010 il WHO (WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen) ha proposto come valori di normalità una percentuale di spermatozoi normali >14%, al di sotto di tali parametri si tratta di teratozoospermia. Tra le alterazioni morfologiche desta particolare attenzione la presenza di spz a testa rotonda (globozoospermia) a causa  dell’assenza della membrana acrosomiale e dell’acrosina, entrambe fondamentali per la penetrazione dello spz. nell’ovocita (5).

  • motilità: è valutata al M.O. ad ingrandimento 20X in diversi campi della camera di Makler. Nell’ultima versione delle linee guida WHO si attribuiscono agli spz tre classi di mobilità: motilità progressiva, motilità non progressiva e spermatozoi immobili. Viene considerato normale un campione seminale con una percentuale >32% di spz dotati di motilità rettilinea o con motilità totale >40% (5,6).
  • pH: in condizioni di normalità il valore seminale del pH è alcalino (range 7.2-7.8). Valori >8 indicano flogosi genitale mentre valori <7 sono presenti in caso di contaminazione del campione o in caso di stenosi dei deferenti o ipotrofia o stenosi delle vescicole seminali.  
  • Leucociti  (v.n.  <1×106/ml) 

ESAMI BIOCHIMICI per lo studio della funzionalità delle ghiandole accessorie: 

  1. D-fruttosio la concentrazione seminale di fruttosio (v.n. 200-600 mg/dl)  è il miglior marker della funzionalità delle vescicole seminali. Dagli studi finora pubblicati, emergono conclusioni discordanti su una correlazione diretta fra la concentrazione del fruttosio seminale e i parametri funzionali degli spz nei pazienti infertili (29-45). 
  2. L-Carnitina e acetil-carnitina seminale: secrete dall’epididimo, assumono un importante ruolo per la produzione di energia,  importante nel metabolismo e nella motilità degli spermatozoi. L’aggiunta di carnitine al medium per la crioconservazione dello sperma sembra utile per conservare la motilità degli spz (46-54). 
  3. Zinco – secreto dalle cellule secretorie della prostata, metallo traccia essenziale per almeno 200 enzimi,  coinvolto nel metabolismo di lipidi, proteine, carboidrati e acidi nucleici. Ha una funzione antiossidante, battericida diretta e indiretta, e stabilizzante della membrana cellulare e la cromatina nucleare degli spermatozoi. In caso di ipertrofia prostatica la secrezione di zinco è immutata o leggermente aumentata mentre risulta nettamente diminuita in caso di adenocarcinoma prostatica. Ci sono dati contrastanti fra i livelli dello zinco nel plasma seminale e i parametri di concentrazione e funzionalità degli spermatozoi mentre tutti si è concordi nell’affermare che lo zinco è indice di funzionalità prostatica (22-28). 
  4. γ-glutamil-transpeptidasi (GT): è un enzima la cui principale funzione è di intervenire nel metabolismo del glutatione, per favorire l’eliminazione delle sostanze tossiche da parte del fegato. I tessuti umani in cui è maggiormente presente la gamma-GT sono rene, pancreas, fegato intestino e prostata. La concentrazione nel liquido seminale (v.n. 5-36 mU/ml) è indice di funzionalità prostatica. 
  5. Fosfatasi acida prostatica (PAP):  glicoproteina secreta dalla prostata e presente nel liquido seminale. I valori di riferimento sono inferiori a 3,7 μg/l La concentrazione di fosfatasi acida prostatica risulta incrementata in tutte le patologie prostatiche:  carcinoma prostatico, prostatiti acute e iperplasia prostatica benigna. La fosfatasi acida prostatica risulta, inoltre, incrementata in corso di metastasi ossee, di ritenzione urinaria e in seguito ad alcune manovre diagnostiche, quali massaggi prostatici, esplorazioni rettali o procedure endoscopiche. In medicina legale, la ricerca della fosfatasi prostatica è effettuata per accertare un avvenuto stupro, giacché la sua presenza in vagina rappresenta la prova di un recente rapporto sessuale.
  6. Gliceril-fosforil-colina (GPC): secreta dall’epitelio epididimario, sembra avere un ruolo stabilizzante sul DNA dello spermatozoo e sulla pressione osmotica endoluminale. La secrezione di GPC è  direttamente correlata alla secrezione di testosterone e DHT; in caso di ostruzione del deferente si osserveranno solo minime tracce di GPC nel liquido seminale (21-22).   

 

 

 

Biochimica liquido seminale
parametro sede di produzione valori normali
Fruttosio  vescichette seminali 200-600 mg/dl
prostaglandine  vescichette seminali  10-35 μg/ml
fosfatasi acida  prostata <3,7 μg/l
γ-glutamil-transpeptidasi prostata  5-36 mU/ml
acido citrico prostata 200-600 mg/dl
zinco prostata 2-40 mg/ml
L-carnitina epididimo 0.2-0.4 μmol/ml
glicero-fosforil-colina epididimo  30-70 mg/dl
glucosidasi neutra epididimo

Citofluorimetria: Per valutare i parametri seminali abbiamo a disposizione le camere di conta e il microscopio; la concentrazione viene valutata utilizzando la camera di Makler o di Neubauer, con le quali noi contiamo solo una piccola parte delle cellule presenti nell’eiaculato ed estrapoliamo pertanto la concentrazione sulla base di una notevole approssimazione; la mobilità, risente fortemente della soggettività dell’operatore che deve discriminare in maniera molto approssimativa i differenti tipi di motilità nemaspermica e la percentuale degli spermatozoi con le diverse tipologie di mobilità; un dato meno soggettivo è rappresentato dalla valutazione della morfologia, ma possiamo contare massimo 100-200 spermatozoi per vetrino, che dal punto di vista statistico sono un numero scarsamente rappresentativo se rapportato alle centinaia di milioni che possono essere presenti nell’eiaculato. Un aiuto in questo senso è venuto verso la fine degli anni ’70 dalla citofluorimetria, inizialmente utilizzata quasi esclusivamente per indagini immuno-onco-ematologiche e successivamente anche per lo studio degli spermatozoi.  La citofluorimetria permette di analizzare campioni cellulari statisticamente accettabili, riducendo in questa maniera il fenomeno della variazione. Il principio su cui si basa la citofluorimetria può essere schematizzato nel seguente modo: una sospensione cellulare viene fatta aspirare dallo strumento, queste cellule si disporranno in un flusso unicellulare che viene intercettato da un raggio laser convogliato da una lente, questo raggio subirà un destino diverso sulla base delle caratteristiche cellulari andando quindi ad essere intercettato da filtri e fotomoltiplicatori che in ultima analisi trasformeranno il segnale elettrico in diagrammi computerizzati.

  La citofluometria a flusso ci permette di valutare i seguenti parametri:
  • concentrazione spermatozoi e cellule rotonde;
  • identificazione degli anticorpi anti-spermatozoo;
  • integrità nemaspermica;
  • vitalità nemaspermica;
  • integrità della membrana;
  • valutazione permeabilità e stabilitàdella membrana;
  • integrità acrosomiale;
  • funzionalità mitocondriale;
CASA (computer-aieded sperm analysis): Analizzatori seminali automatici che consentono di valutare la percentuali di spz mobili e la loro velocità media. E’ noto che molti fattori sono in grado di ridurre l’efficienza degli strumenti CASA, come la preparazione del campione e la concentrazione degli spermatozoi (Davis & Katz, 1992; Mortimer, 1994a, b), per cui è opportuno consultare le linee guida per l’utilizzo di questi apparecchi (Mortimer   et al., 1995; European Society of Human Reproduction and Embriology, 1996). Anche rispettando i controlli di qualità e una cura procedurale rigorosa, fino ad oggi non è stato possibile determinare con il CASA la concentrazione degli spermatozoi, per la difficoltà di distinguere gli spermatozoi dai detriti (European Society of Human Reproduction and Embriology, 1996).  il CASA può essere impiegato nella routine diagnostica del laboratorio per monitorare la concentrazione degli spermatozoi motili progressivi.
MEP-metod (multi exposure photography): analizzatore che utilizza la stroboscopia applicata alla fotografia per valutare oggettivamente la motilità degli spermatozoi (4-6). Il campione di seme, posto in una camera di 10-μm è illuminato con   luce pulsata generata da uno stroboscopio a xenon (pulse intervallo: 160 m/sec., esposizione: 1 sec.) e fotografato attraverso un M.O. a contrasto di fase.
Laser light scattering (laser diffraction): può  analizzare in meno di 1 minuto peso e diametri di un gran numero di microparticelle (da 100 nm a diversi mm) sospese in acqua, emulsioni e sospensioni. 

Test di vitalità:

  1. test all’eosina: si mescolano parti uguali di soluzione al 5% di  eosina Y e liquido seminale; gli spermatozoi danneggiati o morti si colorano in rosso mentre quelli vitali non si colorano.  
  2. swelling test (HOS, test iposmotico): Questo metodo valuta la percentuale di spermatozoi con alterazioni funzionali della membrana cellulare correlate con il grado di integrità del DNA.  Si attua mescolando 0.1 ml di liquido seminale con 1 ml di soluzione di swelling (ipotonica rispetto al liquido seminale) ed incubando per almeno 30 minuti a 37° C (non più di 45 minuti). L’acqua, per osmosi, passa dalla soluzione ipotonica di Swelling all’interno degli spermatozoi ed in seguito a ciò gli spz. normali  si rigonfieranno   mentre quelli con funzione alterata della membrana non si rigonfieranno. Gli spz con rigonfiamento (spz normali)  vengono immersi in una soluzione isotonica che li riporterà a dimensioni normali e saranno utilizzati per la fecondazione in vitro. 
  3. TUNEL test  (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick end Labeling) su liquido seminale per la ricerca di frammentazioni del DNA degli permatozoi: Il test di frammentazione del DNA spermatico o Tunel test, insieme al test  Sperm Chromatin Dispersion (SCD) è un ottimo metodo per valutare, in termini di percentuale, il grado di frammentazione del DNA dei singoli spermatozoi osservati a M.O. ad altissima risoluzione. Nonostante l’elevato grado di attendibilità, una delle principali limitazioni di questa tecnica è che, una volta processati, gli spermatozoi non possono essere utilizzati per la fecondazione in vitro.  Inoltre i risultati possono richiedere fino ad una settimana di tempo (7-18).
  4. Valutazione della reazione acrosomiale indottaa seguito dell’interazione fra l’acrosoma e la zona pellucida, si assiste alla reazione acrosomiale che inizia con l’ingresso di ioni calcio nel citoplasma e l’alcalinizzazione di quest’ultimo. Entrambi questi fenomeni possono essere artificialmente indotti mediante lo ionoforo del calcio A23187.  Nel rimodellamento citoplasmatico gli istoni sono sostituiti dalla protamina (6).
  5. Test di penetrazione nella zona pellucida di ovociti umani: si mettono a contatto gli spz con la zona pellucida, tagliata mediante microdissettori, di ovociti non fertilizzabili conservati in soluzione salina concentrata per diversi mesi derivati da biopsie ovariche, cadaveri o FIV. Si contano gli spz legati alla zona pellucida. 
  6. Test di penetrazione in oocita di hamster zona-free –  La fusione spermatozoo-oocita nel test di penetrazione in oocita di hamster è la stessa che avviene nell’uomo, poiché la fusione con la membrana vitellina dell’oocita inizia dalla membrana plasmatica che riveste il segmento equatoriale dello spermatozoo umano in cui è avvenuta la reazione acrosomiale. Il test differisce dalla situazione fisiologica, invece, per l’assenza della zona pellucida. Il test dell’oocita di hamster si basa sulla reazione acrosomiale, che avviene spontaneamente negli spermatozoi incubati in vitro per un periodo prolungato di tempo. Poiché questa procedura è meno efficiente di quanto non lo siano i processi biologici in vivo, e può coinvolgere anche meccanismi diversi, avviene spesso di ottenere risultati falsi negativi di pazienti i cui spermatozoi non riescono a superare il test dell’oocita di hamster ma riescono a fecondare gli oociti umani in vitro ed in vivo (World Health Organization, 1986).
  7. Test all’arancio di acridina:  gli spz con DNA denaturato si coloreranno in verde.

ALTRI ESAMI SU LIQUIDO SEMINALE

Citologia spermatica su agoaspirato testicolare: permette di studiare l’epitelio germinativo del testicolo e le fasi del processo di gametogenesi.  L’agoaspirazione viene eseguita con un sottile ago, in ambulatorio, previa una anestesia da contatto (spray) con minimo discomfort del paziente. I quadri che emergono sono: normale, sindrome a cellule di Sertoli, blocco maturativo spermatogoniale/spermatocitico, ipospermatogenesi. 

FISH (Sperm Fluorescence In Situ Hybridizations): permette di evidenziare aneuploidie e diploidie spermatiche che sono molto  frequenti nei pazienti con oligoastenospermia grave (12).

Spermiocultura –  Un’infezione del tratto genitale maschile può provocare sterilità sia per azione diretta sugli spermatozoi (riduzione della motilità per effetto dell’adesività batterica o per azione di sostanze spermiotossiche) che attraverso vari meccanismi indiretti. Le infezioni delle vie genitali costituiscono, quindi, una delle cause più frequenti di riduzione della capacità riproduttiva maschile, soprattutto in quelle forme definite “silenti”, asintomatiche, non curate per l’assenza di segni clinici soggettivi; l’intervallo tra il contagio sessuale e la comparsa di infertilità è spesso di molti anni. Prima di raccogliere lo sperma, il paziente deve urinare, dopodiché deve lavarsi le mani ed il pene con sapone, e sciacquare via ogni traccia di sapone ed asciugarsi con un asciugamano pulito. Il contenitore per il liquido seminale deve essere sterile, ed il tempo intercorrente tra raccolta e l’inizio dell’analisi al laboratorio di microbiologia non deve superare le tre ore (19).  I principali agenti patogeni sono:

  1. Neisseria gonorrhoeae: Dopo un breve periodo di incubazione, 4-5 giorni, più dell’80% dei maschi presenta i sintomi dell’infezione primaria. Le uretriti gonococciche acute sono caratterizzate da abbondante essudato cremoso giallastro: nelle forme croniche l’essudato è meno tipico ed abbondante.
  2. Chlamydia trachomatis: è causa di malattie gravi sia per gli scarsi sintomi, sia per le cicatrizzazioni che provoca e che comportano importanti sequele specie per la fertilità. Essa è responsabile di oltre il 50% delle uretriti non gonococciche e di gran parte di quelle post-gonococciche. L’uretrite da Chlamydia può complicarsi con orchi-epididimite, prostatite, vescicolite, tutte causa di anomalie nella produzione, nella funzione e nel trasporto degli spermatozoi, che possono anche comportarsi come veicolo dell’infezione. L’esame viene eseguito su tampone uretrale.
  3. Mycoplasmi – Nell’uomo possono determinare uretriti, prostatiti e prostato-vescicoliti subacute, spesso accompagnate da emospermia; sono stati anche descritti casi di epididimiti e balaniti. Tra gli agenti infettivi i Mycoplasmi sono al primo posto come causa di infertilità maschile.
  4. Trichomonas vaginalis – Colonizza l’uretra, la prostata, le vescicole seminali, l’epididimo ed i testicoli. Spesso si è portatori asintomatici del parassita, potendo manifestare una leggera uretrite che normalmente non induce il paziente ad un controllo medico.

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Autore: FULVIO CESARONI, seminologo ed embriologo

References:

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