Spermiogramma

Ultimo aggiornamento 2020-01-08  20:39:01

Spermiogramma: è l’analisi macroscopica e microscopica del liquido seminale. L’analisi  macroscopica comprende valutazione del volume, aspetto, pH, fluidificazione e viscosità  mentre la fase microscopica intende studiare concentrazione, motilità e morfologia degli spermatozoi al fine di un corretto inquadramento diagnostico del paziente con problemi di fertilità (1-4). 

Lo spermiogramma presenta un’alta variabilità di risultati a causa di numerosi fattori quali l’assunzione di antibiotici, periodi di febbre alta precedenti l’esame, il trasporto impreciso del seme al laboratorio. per tale motivo, in presenza di un esame anomalo, esso deve essere ripetuto a distanza di tempo.

•  Raccolta campione – Il campione iniziale deve essere raccolto tramite masturbazione dopo un periodo di astinenza sessuale di un tempo minimo di 2 giorni ad un massimo di 7  giorni. Rispettare il periodo di astinenza sessuale permette di paragonare i dati seminali a valori standard di normalità. Inoltre, un’astinenza troppo prolungata provoca accumulo di spermatozoi con possibile riduzione della motilità e alterazione della morfologia, mentre un’astinenza troppo breve può causare la riduzione del volume dell’eiaculato e del numero degli spermatozoi. Il liquido seminale deve essere raccolto in un barattolo sterile e mantenuto ad una temperatura stabile (non inferiore a 20°C e non superiore a 30°C) fino al momento dell’analisi, che deve essere effettuata entro un’ora dalla raccolta. La raccolta tramite coito interrotto non è una modalità idonea in quanto si può verificare la perdita della prima frazione dell’eiaculato, che di solito contiene la più alta concentrazione di spermatozoi e può comportare una contaminazione del liquido seminale con secrezioni vaginali che possono interferire sulla motilità degli spermatozoi. 
• La fluidificazione del liquido seminale segue l’iniziale coagulazione; avviene in 15-30 minuti.  Se dopo 60 minuti la fluidificazione non è completa, si parla di fluidificazione ritardata, quadro compatibile con disturbi prostatici. La misurazione viene effettuata facendo percolare il liquido lungo le pareti della provetta osservando la qualità del liquido contro una sorgente luminosa.
• Viscosità –  La misurazione della viscosità avviene facendo gocciolare il liquido da una pipetta, osservando come le gocce dovrebbero susseguirsi in maniera ritmica una dopo l’altra. Una diminuzione della viscosità può associarsi a scarsa componente cellulare spermatica mentre l’aumento della viscosità visibile con la formazione di filamenti può derivare da uno stato di flogosi delle vie spermatiche.
• Volume:  v.n. 1.5-6 ml; il liquido seminale è secreto dalle ghiandole seminali (prostata, vescicole seminali e ghiandole bulbo-uretrali di Cooper). Il volume >6 ml è rappresentato come iperposia e si ritrova spesso in condizioni di flogosi delle vie seminali; un volume seminale <1.5 ml è definito come ipoposia e si riscontra in caso di ostruzione o agenesia dei dotti deferenti, occlusione o agenesia delle vescicole seminali, eiaculazione retrograda parziale, ipogonadismo e problemi immunologici.
• Concentrazione degli spermatozoi: il numero degli spermatozoi è valutato al M.O. utilizzando la camera di Makler (Sefi Medical Instrument, Haifa, Israel). In caso di criptozoospermia però, è necessario ricorrere alla camera di Neubauer che nel quadrato centrale contiene 25 piccoli quadrati ognuno dei quali contiene 20 celle in cui contare gli spermatozoi.   Per l’esame con la camera di Neubauer, in base al numero di spermatozoi che si sono apprezzati con la camera di Makler,  si scelgono le due diluizioni più opportune.  Il valore ottenuto con l’apposita formula (es: Diluizione 1+4 (1:5) C = (N/n) × 0.25; C = concentrazione spz mil/ml, N = numero totale di spermatozoi contati, n = numero di righe contate) viene poi moltiplicato per il volume totale, così da ottenere il numero totale di spermatozoi nell’eiaculato. Il numero medio di spermatozoi totali nel liquido seminale dovrebbe essere 40.000.000-200.000.000 con variazioni fisiologiche del 10-30% fra un esame e l’altro ma negli ultimi decenni si assiste ad una progressiva diminuzione della popolazione spermatozoaria a livello mondiale.  Tale declino è dovuto a condizioni di vita sedentaria, cattiva alimentazione, obesità, diabete, inquinamento ambientale. Nel 2010 la WHO (WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen) realizzò delle linee guida per la valutazione della concentrazione degli spermatozoi nel liquido seminale esprimendo un cut-off di normalità fra 15 e 250 milioni di spz/ml e proponendo quindi la seguente classificazione:
  • spz/ml  <156 : oligospermia lieve
  • spz/ml  <106: oligospermia media
  • spz/ml <5.000.000:  oligospermia severa
  • pochi e rari spermatozoi: criptospermia
  • spz/ml >250×106 polispermia 
• morfologia –  La morfologia è uno dei parametri che meglio riflette l’integrità e la funzionalità degli spermatozoi. Essa è strettamente correlata al tasso di concepimento spontaneo e al tasso di fertilizzazione in vitro. Lo spermatozoo maturo è costituito da una parte anteriore, ovoidale, chiamato testa, seguita da una porzione chiamata collo,  un tratto intermedio e dal tratto finale o coda. La testa contiene  il nucleo a cui è appoggiato anteriormente l’acrosoma che contiene gli enzimi necessari alla penetrazione dello spz nell’ovocita. La morfologia spermatica viene valutata a fresco, appena effettuata la liquefazione completa del liquido seminale, al M.O. in contrasto di fase con ingrandimento a 200-400X  dopo aver strisciato e colorato con Papanicolau il preparato su vetrino. Si contano le percentuali di anomalie su 200 spz e le anomalie vengono suddivise in anomalie della testa, della coda e del pezzo intermedio. Nel 2010 il WHO (WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen) ha proposto come valori di normalità una percentuale di spermatozoi normali >14%, al di sotto di tali parametri si tratta di teratozoospermia. Tra le alterazioni morfologiche desta particolare attenzione la presenza di spz a testa rotonda (globozoospermia) a causa  dell’assenza della membrana acrosomiale e dell’acrosina, entrambe fondamentali per la penetrazione dello spz. nell’ovocita (5).

• motilità: è valutata al M.O. ad ingrandimento 20X in diversi campi della camera di Makler. Nell’ultima versione delle linee guida WHO si attribuiscono agli spz tre classi di mobilità: motilità progressiva, motilità non progressiva e spermatozoi immobili. Viene considerato normale un campione seminale con una percentuale >32% di spz dotati di motilità rettilinea o con motilità totale >40% (5,6).
• pH: in condizioni di normalità il valore seminale del pH è alcalino (range 7.2-7.8). Valori >8 indicano flogosi genitale mentre valori <7 sono presenti in caso di contaminazione del campione o in caso di stenosi dei deferenti o ipotrofia o stenosi delle vescicole seminali.  
• Leucociti  (v.n.  <1×10⁶/ml) 

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Citofluorimetria: Per valutare i parametri seminali abbiamo a disposizione le camere di conta e il microscopio; la concentrazione viene valutata utilizzando la camera di Makler o di Neubauer, con le quali noi contiamo solo una piccola parte delle cellule presenti nell’eiaculato ed estrapoliamo pertanto la concentrazione sulla base di una notevole approssimazione; la mobilità, risente fortemente della soggettività dell’operatore che deve discriminare in maniera molto approssimativa i differenti tipi di motilità nemaspermica e la percentuale degli spermatozoi con le diverse tipologie di mobilità; un dato meno soggettivo è rappresentato dalla valutazione della morfologia, ma possiamo contare massimo 100-200 spermatozoi per vetrino, che dal punto di vista statistico sono un numero scarsamente rappresentativo se rapportato alle centinaia di milioni che possono essere presenti nell’eiaculato. Un aiuto in questo senso è venuto verso la fine degli anni ’70 dalla citofluorimetria, inizialmente utilizzata quasi esclusivamente per indagini immuno-onco-ematologiche e successivamente anche per lo studio degli spermatozoi.  La citofluorimetria permette di analizzare campioni cellulari statisticamente accettabili, riducendo in questa maniera il fenomeno della variazione. Il principio su cui si basa la citofluorimetria può essere schematizzato nel seguente modo: una sospensione cellulare viene fatta aspirare dallo strumento, queste cellule si disporranno in un flusso unicellulare che viene intercettato da un raggio laser convogliato da una lente, questo raggio subirà un destino diverso sulla base delle caratteristiche cellulari andando quindi ad essere intercettato da filtri e fotomoltiplicatori che in ultima analisi trasformeranno il segnale elettrico in diagrammi computerizzati.

  La citofluometria a flusso ci permette di valutare i seguenti parametri:

• concentrazione spermatozoi e cellule rotonde;
• identificazione degli anticorpi anti-spermatozoo;
• integrità nemaspermica;
• vitalità nemaspermica;
• integrità della membrana;
• valutazione permeabilità e stabilitàdella membrana;
• integrità acrosomiale;
• funzionalità mitocondriale;

CASA (computer-aieded sperm analysis): Analizzatori seminali automatici che consentono di valutare la percentuali di spz mobili e la loro velocità media. E’ noto che molti fattori sono in grado di ridurre l’efficienza degli strumenti CASA, come la preparazione del campione e la concentrazione degli spermatozoi (Davis & Katz, 1992; Mortimer, 1994a, b), per cui è opportuno consultare le linee guida per l’utilizzo di questi apparecchi (Mortimer   et al., 1995; European Society of Human Reproduction and Embriology, 1996). Anche rispettando i controlli di qualità e una cura procedurale rigorosa, fino ad oggi non è stato possibile determinare con il CASA la concentrazione degli spermatozoi, per la difficoltà di distinguere gli spermatozoi dai detriti (European Society of Human Reproduction and Embriology, 1996).  il CASA può essere impiegato nella routine diagnostica del laboratorio per monitorare la concentrazione degli spermatozoi motili progressivi.

MEP-metod (multi exposure photography): analizzatore che utilizza la stroboscopia applicata alla fotografia per valutare oggettivamente la motilità degli spermatozoi (4-6). Il campione di seme, posto in una camera di 10-μm è illuminato con   luce pulsata generata da uno stroboscopio a xenon (pulse intervallo: 160 m/sec., esposizione: 1 sec.) e fotografato attraverso un M.O. a contrasto di fase.

Laser light scattering (laser diffraction): può  analizzare in meno di 1 minuto peso e diametri di un gran numero di microparticelle (da 100 nm a diversi mm) sospese in acqua, emulsioni e sospensioni. 

ALTRI ESAMI SU LIQUIDO SEMINALE

1. Citologia spermatica su agoaspirato testicolare: permette di studiare l’epitelio germinativo del testicolo e le fasi del processo di gametogenesi.  L’agoaspirazione viene eseguita con un sottile ago, in ambulatorio, previa una anestesia da contatto (spray) con minimo discomfort del paziente. I quadri che emergono sono: normale, sindrome a cellule di Sertoli, blocco maturativo spermatogoniale/spermatocitico, ipospermatogenesi. 
2. FISH (Sperm Fluorescence In Situ Hybridizations): permette di evidenziare aneuploidie e diploidie spermatiche che sono molto  frequenti nei pazienti con oligoastenospermia grave (12). 
3. Test di frammentazione del DNA spermatico: Si tratta di un esame che permette di valutare la percentuale degli spermatozoi con DNA integro e con DNA frammentato. Infatti, elevati livelli di frammentazione del DNA spermatico sono associati a condizioni di infertilità maschile e ad una maggiore incidenza di aborti precoci, anche dopo tecniche di fecondazione in vitro (IVF).

Il test è consigliato:

♦ quando i parametri dello spermiogramma sono normali e non si riesce ad ottenere una gravidanza;

♦ in caso di fallimento dei cicli IVF;

♦ in caso di aborti ripetuti;

♦ per le donne oltre i 40 anni, perché gli ovociti hanno una ridotta capacità di riparazione degli errori del DNA spermatico.

Il campione deve essere raccolto dopo un periodo di astinenza sessuale (più precisamente eiaculatoria) di non meno di 3 giorni e non più di 5 giorni.

• La raccolta del campione deve essere effettuata in laboratorio o presso la propria abitazione; in tal caso il campione dovrà essere consegnato entro 1 ora (max 90 minuti)
• Il campione dovrà essere ottenuto per masturbazione e raccolto in un contenitore sterile dall’apertura sufficientemente larga
• Il campione deve essere protetto dalle alte e dalle basse temperature (inferiori a 20° e superiori a 40° C) durante il traferimento in laboratorio

Spermiocultura – 

Esami biochimici su liquido seminale

Tests di vitalità

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Autore: FULVIO CESARONI, seminologo ed embriologo

References:

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